지시약의 pKa 결정 (feat. 분광광도법)
흡광도 측정을 통한 지시약의 pKa 결정
0. 들어가기
산-염기 지시약(Acid-Base Indicator)은 일반적으로 약한 산 또는 약한 염기의 성질을 갖는다. 그렇다고 해서, 모든 약한 산과 약한 염기를 지시약으로 쓸 수 있다는 말은 아니다.
산-염기 지시약으로 사용되기 위해서는 지시약의 짝산(HIn)과 짝염기(In-) 구조의 색깔이 달라 서로 구별될 수 있어야 한다. 대표적인 산-염기 지시약인 브로모티몰 블루(Bromotymol Blue, BTB)는 산 형태(HIn)에서 노랑색, 염기 형태(In-)에서 파랑색을 띤다.
용액 pH에 따른 BTB 지시약 색변화를 조금 더 자세히 들여다보자.
BTB 지시약이 수소 이온(H3O+)이 풍부한 산성 용액에 있으면, BTB는 대부분 산성형(짝산형, HIn) 구조에 치우쳐 존재하고, 용액 전체 색깔은 노랗게 보인다.
반면, BTB 지시약이 염기 용액에 있으면, 주위 풍부한 수산화 이온(OH-)으로 인해 BTB 대부분은 수소 이온(H+)을 잃고 염기성형(짝염기형, In-) 구조로 존재하게 된다. 그리고 용액 전체 색깔은 푸르게 보인다.
즉, 용액 pH에 따라, 지시약의 평형이 정반응 또는 역반응 쪽으로 이동하고, 산성 형태(HIn)와 염기성 형태(In-)의 비율이 달라지면서 용액 색깔이 달라진다. 일반적으로, 용액은 더 많은 비율로 존재하는 구조의 색으로 보이겠지만, 만약 산성형과 염기성형 두 구조가 엇비슷하게 존재한다면, 노란색과 푸른색이 섞인 초록색으로 보일 것이다.
이번 글을 통해서는 용액 pH에 따른 흡광도 측정을 통해 지시약 고유의 산해리상수인 pKa를 결정하는 실험에 대해 알아보도록 하고자 한다.
1. 이론적 배경
1) 지시약의 변색 범위
지시약이 포함된 용액의 색깔은 지시약의 종류와 용액의 pH가 결정한다. 일반적으로 지시약의 짝산-짝염기 형태 중 한 가지가 나머지에 비해 10배 이상 풍부하면(과량), 특정 구조에 의한 색깔이 지배적으로 관찰된다.
이를 달리 생각해보면, 특정 구조가 과량 존재하지 않는다면 짝산-짝염기 비율에 따라 색깔이 연속적으로 달라지는 중간 영역이 존재한다는 뜻이다. 우리는 이 구간을 지시약의 변색 범위, 변색 구간(indicator range)이라 한다.
BTB의 경우 변색 범위가 6.0 ~ 7.6이고, 메틸레드(Methyl Red, MR)는 4.2 ~ 6.3이다. 일반적으로 지시약의 변색 범위는 pKa ±1 에 해당한다.
2) 헨더슨-하셀바흐 식(Henderson-Hasselbalch equation)
헨더슨-하셀바흐 식은 약산의 해리 반응(HA → H+ + A-)에 대한 산 이온화 상수(평형 상수) 식을 기본으로 pH, pKa, 약산-짝염기 비율의 형태로 정리한 식을 말한다. 이 식은 용액 내 존재하는 화학종의 종류(pKa)와 용액 환경(pH)에 따른 짝산/짝염기 비율([A-]/[HA])을 파악하는데 유용하다. 이에 완충 용액이나 지시약의 작동 원리를 설명하는 과정에서 자주 언급된다.
2. 실험 목적
용액 pH 변화에 따른 흡광도 측정을 통해, 지시약의 산 해리 상수(pKa)를 결정한다.
3. 실험 원리
지시약은 서로 색이 다른 두 구조(산성형, 염기성형) 사이를 상호 변환한다. 만약, 용액 pH가 지시약 변색 범위 밖이라면, 하나의 화학종이 나머지 화학종에 비해 과량 존재하는 것으로 생각할 수 있으며, 전체 화학종이 산성형(HIn) 또는 염기성형(In-) 중 하나로만 존재한다고 여길 수 있다. (변색 범위 밖에서는 용액의 색깔이 지시약의 한가지 구조에 의해서만 결정된다.)
하지만, 용액 pH가 지시약 변색 범위 안쪽이라면, 산성형(HIn) 와 염기성형(In-) 구조가 함께 존재하고, 용액 pH 환경에 따라 그 비율이 다르다.
1) 용액 pH와 흡광 스펙트럼
어떤 물질의 '색'이 다르다는 것은, 그 물질이 주로 '흡수하는 빛의 파장'이 다르다는 뜻이다. 그리고 우리가 눈으로 물질의 색을 구별할 수 있다는 것은 물질이 흡수하는 빛의 파장이 가시광선 영역에 해당한다는 것을 의미한다.
지시약은 구조에 따라 색이 구별되고, 이는 두 구조가 주로 흡수하는 빛의 파장 영역이 다름을 뜻한다. BTB 지시약을 예로 들면, 산성형 HIn이 433 nm 부근, 염기성형 In-는 616 nm 부근에서 최대 흡수 띠(λmax)를 갖는다.
433 nm는 보라색 빛, 616 nm는 주황색 빛에 해당하는데, 흡수하는 빛의 파장과 겉보기 색 사이의 '보색 원리'에 따라 용액 속에 HIn이 많으면, 노란색, In-가 많으면, 파란색으로 보이게 된다.
BTB 지시약은 '변색 범위 밖' 염기성 용액(pH ≫ 7.6)에서는 위의 푸른색 흡광 스펙트럼 개형을 갖는다. 616 nm 부근에서 최대 흡수 봉우리(λmax)를 가지며, 이 흡수 띠는 압도적인 비율([In-] ≫ [HIn])로 존재하는 BTB의 염기성형 구조(In-)에 의한 것임을 알 수 있다.
(변색 범위 밖) 염기성 용액 내에서는 거의 대부분의 BTB가 모두 염기성형 구조로 존재한다고 할 수 있으며, 용액 내 존재하는 In- 농도와 초기 농도 c 는 같다고 할 수 있다. BTB 용액의 초기 농도 c, [In-]염기용액, 흡광도 A616nm, 염기용액 사이의 관계를 나타내면 다음과 같다.
염기 용액에 산성 물질(H+)을 첨가하여 용액 전체의 pH가 점점 낮아지게 되면, 압도적인 비율로 존재했던 염기성형 In- 가 점차 산성형 HIn 으로 변하게 된다. 자연스레 In- 에 의한 흡수 봉우리인 616 nm 부근 흡광도는 감소(그림 5, 좌)하고, HIn에 의한 433 nm 부근 흡광도가 증가(그림 5, 좌)한다. 더 첨가된 산성 물질의 양에 따라 용액 내 존재하는 HIn과 In-의 비율이 점차 달라지게 되며, 각 화학종의 농도 변화는 616 nm 또는 433 nm의 흡광도 값 변화를 통해 알 수 있다.
결국, 변색 범위 안쪽(중성) pH에서는 HIn과 In-가 공존하고, HIn의 농도는 433 nm 부근의 흡광 봉우리 높이(그림 5, 오른쪽)로, In-의 농도는 616 nm 부근의 흡광 봉우리 높이(그림 5, 오른쪽)로 확인할 수 있다. 용액 내 지시약의 양은 일정하고 전체 부피 변화가 없다면, 지시약의 전체 농도 c 또한 처음과 같게 일정하게 유지될 것이다.
변색 범위 안쪽 용액에 산성 물질(H+)을 지속적으로 첨가하여 pH를 더욱 낮아지게 하다가 (BTB 변색 범위 밖) 산성 용액(pH ≪ 6.0)이 된다면, 위 그림 4의 노란색 스펙트럼 형태를 갖게 된다. 433 nm 부근에서 최대 흡수 파장을 갖고, 이 흡수띠는 압도적인 비율([In-] ≪ [HIn])로 존재하는 BTB의 산성형 구조(HIn)에 의한 것이라고 할 수 있다. (노란색 흡광 스펙트럼에서 616 nm 부근의 흡광도가 0에 가까워진 것을 알 수 있다.(그림 6.))
2) 산성형-염기성형 화학종 농도 비 [In-]/[HIn]
변색 범위 부근의 pH에서의 용액 흡광도는 산성형 구조 HIn과 염기성형 구조 In- 모두에 의해 나타난다. 초기 용액이었던 염기 용액의 616 nm 부근 흡광도 변화를 기준으로 하여 화학종의 비를 나타내보자. 616 nm 부근 흡광도만 사용한다는 것은 용액 pH 변화에 따른 In- 농도 변화에만 관심을 갖겠다는 뜻이기도 하다.
[1] pH > 7.6 이상의 염기 용액의 흡광 스펙트럼을 측정하자. 위의 그림 7의 파란색 그래프를 얻을 수 있을 것이다. 가장 높은 봉우리인 616 nm 부근의 흡수띠는 용액 내 지배 화학종인 In- 에 의한 것이며, 초기 농도 c = [In-]염기용액 이다.
[2] 염기 용액에 산성 물질(H+)을 서서히 첨가하여, 용액의 pH를 낮추자. 용액의 pH가 변색 구간에 도달하여 위 그림 7의 녹색 그래프가 되었다. 용액의 pH가 낮아짐에 따라 616 nm 부근의 흡수 봉우리도 점차 낮아짐을 알 수 있다. 이는 용액 내 지배적으로 존재하던 In- 가 첨가된 H+와 반응하여 HIn이 되었기 때문에 나타나는 결과이다.
[3] 즉, 감소한 616 nm 부근의 흡광도는 감소한 In- 농도에 의존하며, 이는 생성된 HIn의 농도에 해당한다.
[4] 중성 용액에서 나타나는 흡수띠인 A616, 중성 는 여전히 남아있는 In-에 의한 것이다.
[5] 중성 용액에서의 [In-]/[HIn]을 나타내면 다음과 같다.
3) pH와 log([In-]/[HIn]) 그래프
위의 헨더슨-하셀바흐 식의 짝산-짝염기 농도 비율([In-]/[HIn])에 관한 항을 흡광도 값(A)으로 나타낼 수 있게 되었다.
이제 pH > 7.6 의 염기성 용액의 pH 값, 기준 파장(616 nm)에서의 흡광도(A) 측정을 시작으로, 산성 물질(H+)을 점점 첨가하면서 낮은 pH 용액으로 변화시키자. 그리고 변색 범위 내의 몇몇 지점에서 pH 값, 흡광도 값를 기록하자. 그리고 pH < 4.0 이하의 산성 용액에서 마지막 pH와 흡광도를 기록하여 아래와 같은 표를 만들자.
위의 식과 표를 바탕으로, x축을 log([In-]/[HIn]), y축을 pH로 기준한 좌표 평면에 데이터를 입력하고, 기울기가 1인 추세 그래프를 그려보자. 이 그래프의 y-절편이 pKa 값이 된다.
우리는 몇 가지 용액을 만들고 pH와 그에 대한 흡광도를 측정하여 BTB의 pKa 값을 결정할 수 있게 되었다.
4. 정리
비어 법칙은 측정된 흡광도를 통해 용액의 농도를 알 수 있게 해주며, 헨더슨-하셀바흐 식을 이용하면 용액의 pH, 화학종의 pKa, 용액 내 화학종의 농도 비 사이의 관계를 확인할 수 있다.
용액의 pH에 따라 지시약 화학종의 존재 비율이 달라지고, 지시약은 구조에 따른 색깔 차이를 갖는다는 점에 기초하여 용액의 pH 값과 따른 흡광도 값을 측정하면, 지시약의 pKa를 결정할 수 있다. 본문에서는 용액의 pH가 변화하는 과정 중의 616 nm 부근 흡광도 값 측정을 통해 지시약 화학종의 존재 비율을 확인했다.
용액의 pH ↔ 지시약 화학종 존재 비율 변화 ↔ 용액의 색 변화 ↔ 파장별 흡광도 변화
흡수 스펙트럼의 흡광도 봉우리 중 어디를, 어떤 방식으로 활용하는가에 따라 헨더슨-하셀바흐식은 다른 형태로 표현될 수도 있다. 본문에서 설명한 방식은 단일 파장 616 nm 부근 값만 단순하게 이용하여 계산했지만, 아래와 같이 변색 범위 내의 몇 가지 중성 용액에서의 433 nm 흡광도와 616 nm 흡광도를 한꺼번에 활용하여 pKa를 구할 수도 있다.
세부 방법이 어떻든, 지시약의 존재 비율을 흡광 스펙트럼 봉우리 높이 변화를 통해 구하고, 존재 비율과 용액 pH 값을 바탕으로 그래프를 도시하여 pKa 값을 구한다는 원리는 같다.
-끝-
* 끝까지 읽어주셔서 감사합니다.